LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通過(guò)電子載體將顯色劑還原生成顯色物質(zhì)，在450nm處的OD值與LDH成正比，利用此原理可以測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的LDH漏出情況。

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LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8306

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

LDH反應(yīng)液2-8℃避光保存，長(zhǎng)期不用可-20℃保存，避免反復(fù)凍融。提取液2-8℃保存。有效期1年。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

LDH乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通過(guò)電子載體將顯色劑還原生成顯色物質(zhì)，在450nm處的OD值與LDH成正比，利用此原理可以測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的LDH漏出情況。

LDH（乳酸脫氫酶）是存在于細(xì)胞質(zhì)的一種酶，LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，LDH會(huì)釋放到培養(yǎng)基中。由于釋放出的LDH穩(wěn)定，檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的量可以作為測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)。

LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法：

● 酶標(biāo)儀 ● 分光光度計(jì)

樣本類(lèi)型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 酶標(biāo)儀/分光光度計(jì) ● 離心機(jī) ● 移液器 ● ● PBS緩沖液/HBSS（無(wú)酚紅） ● 96孔板

注意事項(xiàng)：

● LDH反應(yīng)液凍存后溶解時(shí)注意重新混勻。

● 冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測(cè)定。

● 因?yàn)槊糠N細(xì)胞的LDH量不同，建議通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定高LDH對(duì)照和低LDH對(duì)照的吸光度差異最大的細(xì)胞數(shù)。

● 培養(yǎng)基中動(dòng)物血清中的LDH會(huì)增加背景吸收，建議設(shè)置一個(gè)培養(yǎng)基背景對(duì)照來(lái)校正。

● 動(dòng)物血清中的LDH活性較高時(shí)，可以通過(guò)降低血清濃度來(lái)減小其中的LDH造成的背景吸收，一般將血清濃度降低到5%會(huì)顯著減小背景。

● 細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過(guò)大，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。

● 若需準(zhǔn)確計(jì)算出漏出的LDH酶活性的絕對(duì)活性，請(qǐng)選用其它貨號(hào)的試劑盒。

● 不同樣本的LDH漏出情況不一樣，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定加入LDH反應(yīng)液后的孵育時(shí)間。

● 以下以96孔板培養(yǎng)為例，如果是使用的其它類(lèi)型的培養(yǎng)板，以實(shí)際為準(zhǔn)，等比例調(diào)整吸入對(duì)應(yīng)規(guī)格的試劑即可。

● 因?yàn)槊糠N細(xì)胞的LDH量不同，為了得到最好的顯色效果，推薦做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳細(xì)胞量。沒(méi)條件做細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)化的話(huà)，可以選擇較高細(xì)胞量實(shí)驗(yàn)。

LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒使用方法：

關(guān)于對(duì)照孔設(shè)置：

● 一般按以下設(shè)置對(duì)照孔，僅供參考，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自己設(shè)置：（例如加入100μL細(xì)胞懸液，加入藥物母液1-10μL。）

背景空白對(duì)照：保留兩個(gè)或三個(gè)孔，使其不添加細(xì)胞和藥物以用作背景空白對(duì)照。

向每個(gè)孔中添加110μL新鮮培養(yǎng)基。

待測(cè)樣品空白對(duì)照：使兩孔或三孔沒(méi)有細(xì)胞，添加培養(yǎng)基和待測(cè)藥物樣品用作樣品空白對(duì)照。

加入60μL新鮮培養(yǎng)基+ 50μL待測(cè)藥物樣品。

低LDH對(duì)照：使兩孔或三孔含有細(xì)胞，無(wú)添加藥物，用作低LDH對(duì)照。

加入60μL新鮮培養(yǎng)基+ 50μL細(xì)胞懸液。

高LDH對(duì)照：使兩或三孔含有細(xì)胞，無(wú)添加藥物，加入LDH提取液用作高LDH對(duì)照。

加入50μL新鮮培養(yǎng)基+ 50μL細(xì)胞懸液+10μL LDH提取液。

高LDH空白對(duì)照：使兩孔或三孔不含細(xì)胞，無(wú)添加藥物，加入LDH提取液用作高LDH空白對(duì)照。

加入100μL新鮮培養(yǎng)基+10μL LDH提取液。

表A：

	待測(cè)樣品	背景空白對(duì)照	待測(cè)樣品空白對(duì)照	低LDH對(duì)照	高LDH對(duì)照	高LDH空白對(duì)照
培養(yǎng)基	10μL	110μL	60μL	60μL	50μL	100μL
細(xì)胞	50μL	-	-	50μL	50μL	-
藥物	50μL	-	50μL	-	-	-
LDH提取液	-	-	-	-	10μL	10μL

LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒LDH測(cè)定：

1、吸取50μL用培養(yǎng)基稀釋過(guò)的細(xì)胞懸液至96孔板中。

【注】：

● 用貼壁細(xì)胞時(shí)，接種細(xì)胞至96孔板過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)，換成新的50μL培養(yǎng)基后，進(jìn)行操作步驟2。

2、加入50μL含有藥物的培養(yǎng)基（按表A）。

3、在37℃ CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)合適的時(shí)間。

4、在高LDH對(duì)照孔、高LDH空白對(duì)照孔中加入10μL LDH提取液后，在樣品、樣品空白、低LDH對(duì)照孔和背景空白孔中加入10μL 培養(yǎng)基（按表A），在37℃ CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-45分鐘。

【注】：

● 加入LDH提取液的孔用移液器輕輕吹打混勻，中間每隔10分鐘用移液器輕輕吹打混勻。

● LDH提取液比較粘稠，容易吸附在吸頭壁，一定要注意有效加入培養(yǎng)基并充分混勻。

● 可以根據(jù)樣品數(shù)量，按照每50μL培養(yǎng)基+10μL LDH提取液的比例預(yù)先多配制一些提取液的工作液，放大體積后提取液的終濃度會(huì)更加準(zhǔn)確。

● 如果是其它培養(yǎng)體系，LDH提取液按孔中液體量10%加入即可。

5、96孔板離心2 min (250×g)，使懸浮細(xì)胞沉淀。

6、從每個(gè)孔中吸取100μL上清液至另一個(gè)新的96孔板中。

【注】：

● 為了避免吸出細(xì)胞，請(qǐng)小心吸取上清液。

7、在新的96孔板每個(gè)孔中加入10μL LDH反應(yīng)液B后，在室溫避光的條件下培養(yǎng)30鐘-4小時(shí)。

【注】：

● 培養(yǎng)時(shí)間與預(yù)實(shí)驗(yàn)在每孔中加入10μL LDH反應(yīng)液，采用包裹鋁箔等方法避光，在室溫反應(yīng)一致。

● 一般45分鐘-60分鐘反應(yīng)時(shí)間即可。

● 如果是其它培養(yǎng)體系，LDH反應(yīng)液按孔中液體量10%加入即可。

8、用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm的吸光度。

LDH計(jì)算：

計(jì)算待測(cè)樣品孔-樣品空白孔、高LDH對(duì)照孔-高LDH對(duì)照空白孔、低LDH對(duì)照孔-背景空白孔的吸光度后，算出各種孔的復(fù)孔平均值。

細(xì)胞損傷率/毒性根據(jù)如下公式算出。

細(xì)胞損傷率/死亡率/毒性(%) = [(OD_A-OD_C)/(OD_B-OD_C)]×100%

LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒其中：

OD_A：樣品的吸光度(待測(cè)樣品孔-樣品空白孔)

OD_B：高LDH對(duì)照的吸光度(高LDH對(duì)照孔-高LDH對(duì)照空白孔)

OD_C：低LDH對(duì)照的吸光度(低LDH對(duì)照孔-背景空白孔)

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