TRITC-Phalloidin染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。TRITC-Phalloidin可以廣泛用于固定、通透性細(xì)胞，但也可以進(jìn)入活細(xì)胞中。

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TRITC-Phalloidin染色試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8599

產(chǎn)品組成：

TRITC-Phalloidin染色試劑盒儲(chǔ)存條件：

染料-20℃避光保存；稀釋液2-8℃保存。有效期6個(gè)月。

【注】：

● 染料短期2 周內(nèi)可以2-8℃保存。染料長(zhǎng)期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 染色液A 為DMSO 溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

細(xì)胞骨架染色試劑盒采用絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin熒光染色法染色細(xì)胞骨架，可以用于各種動(dòng)物、植物的細(xì)胞骨架染色。本試劑盒采用熒光探針TRITC(Rhodamine，羅丹明，Tetramethylrhodamine Isothiocyanate)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)來標(biāo)記骨架蛋白F-actin。TRITC為橙紅色熒光探針。

細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是真核細(xì)胞中由蛋白質(zhì)聚合而成的三維纖維狀網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中間纖維。細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用。細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白是球形的、大約42kd蛋白，在幾乎所有的真核細(xì)胞都存在。這是一個(gè)非常保守的蛋白，在各物種差異不超過20%。肌動(dòng)蛋白是兩種細(xì)胞內(nèi)絲狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)成單體：微絲(三種主要的細(xì)胞骨架成分之一)，以及細(xì)肌絲(是肌肉細(xì)胞收縮復(fù)合物的一部分)。肌動(dòng)蛋白參與很多重要的細(xì)胞功能，包括肌肉收縮，細(xì)胞移動(dòng)，細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂、小泡和細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形態(tài)的保持和建立。

顯示細(xì)胞骨架的常用方法有兩種：骨架蛋白染色法和免疫熒光染色法。骨架蛋白染色法具有簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，但不能區(qū)分骨架蛋白的組成，有些類型的纖維太細(xì),在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，常用于骨架形態(tài)及完整性研究；免疫熒光染色法可特異顯示骨架蛋白，是用一種微絲解聚抑制劑,它與肌動(dòng)蛋白纖絲有強(qiáng)親和作用,使肌動(dòng)蛋白纖絲穩(wěn)定,抑制解聚,且只與F-actin結(jié)合.因此,利用熒光標(biāo)記可以清晰顯示細(xì)胞中微絲的形態(tài),利用熒光顯微鏡對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察,可以得到清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.具有更普遍的應(yīng)用意義。

TRITC-Phalloidin染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。TRITC-Phalloidin可以廣泛用于固定、通透性細(xì)胞，但也可以進(jìn)入活細(xì)胞中。

TRITC-Phalloidin染色試劑盒試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● PBS緩沖液 ● 固定液4%多聚甲醛 ● 透化液0.05-0.1% Triton X-100(溶于PBS) ● 100 nM DAPI溶液 ● 蓋玻片周圍密封液(如透明指甲油) ● 純水 ● 載玻片和蓋玻片

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體損失。

● 標(biāo)本應(yīng)新鮮，且未受其他化學(xué)物品污染。

● 應(yīng)根據(jù)組織、細(xì)胞類型不同調(diào)整通透時(shí)間。

● 動(dòng)物細(xì)胞樣本細(xì)胞通透劑處理的時(shí)間很關(guān)鍵，如果處理時(shí)間太短，會(huì)造成很深的背景顏色，干擾細(xì)胞骨架的觀察；如果處理時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂，造成細(xì)胞空洞。通透時(shí)間應(yīng)控制在10-35分鐘。需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的染色結(jié)果確定最佳通透時(shí)間。一般預(yù)實(shí)驗(yàn)起始通透時(shí)間植物樣本為10分鐘，動(dòng)物細(xì)胞樣本5分鐘。

● 染色液染色時(shí)間根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行調(diào)整，顏色過淺可延長(zhǎng)染色時(shí)間，顏色過深可縮短染色時(shí)間。

● 洗片時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免將細(xì)胞從玻片上洗掉。

● 染色后用水充分洗滌，自然晾干即可，不能用常規(guī)的酒精梯度脫水方法。

● 不同樣本的操作方法稍有差異，請(qǐng)根據(jù)具體樣本操作。

● 下面以細(xì)胞爬片/涂片樣本的染色為例，滴加相應(yīng)的試劑到玻片上，加樣量以覆蓋樣本即可。如果是植物切片等，也可以在離心管、試管等里面進(jìn)行洗滌、通透、染色等操作，最后置載玻片上觀察即可。

使用方法：

1. 染色工作液配制：

根據(jù)樣本數(shù)量，用染料稀釋液將TRITC-Phalloidin熒光染料10倍稀釋。

再用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液(如HBSS、PBS等)將熒光染料進(jìn)行10倍稀釋，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以不使用本試劑盒中的試劑B，直接用相應(yīng)的培養(yǎng)基或HBSS等緩沖液稀釋染料至所需濃度。

● 開始實(shí)驗(yàn)前，使用培養(yǎng)基或HBSS緩沖液稀釋染料儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。工作濃度應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，建議至少在超過10 倍范圍的濃度下進(jìn)行測(cè)試。一般染色終濃度50-150 倍稀釋，100倍適合大多數(shù)細(xì)胞樣本。

● 工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度。起始測(cè)試工作濃度可以用100倍稀釋。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

2. 將制作好的細(xì)胞爬片/細(xì)胞涂片用37℃預(yù)熱的1×PBS(pH 7.4)清洗2次。

3. 細(xì)胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定5-10分鐘，立即用PBS洗滌3-5次。

【注】：

● 避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

● 樣本多時(shí)可用容器裝好PBS分別浸泡洗滌3-5次，樣本較少時(shí)也可以加500μL PBS到玻片上進(jìn)行洗滌。

● 此步驟為動(dòng)物細(xì)胞樣本的步驟，植物切片類不需要做此步驟，第2步洗滌完直接進(jìn)行第4步通透即可。

4. 室溫條件下，透化細(xì)胞：滴加0.05-0.1% Triton X-100/PBS溶液透化處理樣本，處理3-5分鐘。

【注】：

● 經(jīng)Triton破膜過度后，TRITC-Phalloidin可能對(duì)細(xì)胞核有非特異性染色，注意通透時(shí)間。

● 該步驟可以省略，因?yàn)門RITC-Phalloidin分子量比較小，多聚甲醛固定后細(xì)胞膜產(chǎn)生的部分孔洞可以讓TRITC-Phalloidin進(jìn)入細(xì)胞。

5. 室溫條件下，用PBS洗細(xì)胞3-5次，自然晾干。

6. 室溫條件下，染色：用適量細(xì)胞骨架染色液工作液，覆蓋住玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育40分鐘-更長(zhǎng)時(shí)間，最長(zhǎng)可以過夜染色，一般40分鐘-1小時(shí)即可。

【注】：

● 可以在染色工作液內(nèi)加入終濃度為1% BSA，能起到降低背景的作用；

● 或者在染色前用含1% BSA的PBS液室溫封閉細(xì)胞20-30分鐘。

● 孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

7. 用PBS洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。自然晾干。

8. 使用適量濃度為100nM的DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30 秒即可。

【注】：

● 此步驟為選做步驟，可以不進(jìn)行核復(fù)染。

● 也可以根據(jù)需要選擇其它顏色的核染料。

9. 用PBS洗細(xì)胞。

10. 用激光共聚焦顯微鏡觀察。TRITC-Phalloidin激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)540-545/565-595nm和DAPI激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)359-364/454-461nm。

【注】：

● 或封片后觀察。

● 標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做染色分析。

染色結(jié)果：

細(xì)胞骨架纖維呈橙紅色。細(xì)胞核呈藍(lán)色(如果DAPI復(fù)染)。

細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表面分布許多排列不規(guī)則的纖維束，走向清晰。

【注】：

● 如果見到部分細(xì)胞骨架纖維并非呈纖維狀，而是呈串珠狀或顆粒狀，可以進(jìn)一步優(yōu)化通透、染色時(shí)間、染液濃度等條件。

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