本公司專業(yè)研究及經(jīng)營農(nóng)獸藥殘留檢測試劑、生化試劑、酶及農(nóng)藥獸藥殘留檢測專用酶、標準品、固相萃取柱、色譜柱、實驗室儀器設(shè)備等實驗耗材的新技術(shù)推廣，公司所代理的產(chǎn)品均為我國農(nóng)牧業(yè)系統(tǒng)內(nèi)科研單位及相關(guān)檢測機構(gòu)認可并廣泛推廣使用的國內(nèi)外知名品牌。產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，技術(shù)可靠。公司依托于多家農(nóng)牧業(yè)系統(tǒng)的科研單位和相關(guān)檢測機構(gòu)，并且建立了良好的技術(shù)合作關(guān)系。公司擁有一批從事食品化學分析、農(nóng)藥獸藥殘留檢測工作的專業(yè)技術(shù)人員，可隨時為用戶提供最完善的檢測技術(shù)咨詢服務，并為初步涉及農(nóng)產(chǎn)品、畜產(chǎn)品檢測單位提供實驗室整體方案設(shè)計及技術(shù)人員培訓等全程技術(shù)指導工作。 專業(yè)研究及經(jīng)營農(nóng)獸藥殘留檢測試劑、生化試劑、酶及農(nóng)藥獸藥殘留檢測專用酶、標準品、固相萃取柱、色譜柱、實驗室儀器設(shè)備等實驗耗材并廣泛推廣國內(nèi)外知名品牌

產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒

英文名稱：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）real-time RT-PCR Test Kit

【包裝規(guī)格】50 份/盒

【預期用途】

豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，采用實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（real-timeRT-PCR ）技術(shù)檢測豬血清和組織中的PRRSV，適用于PRRSV 的檢測、診斷和流行病學調(diào)查。

【檢測原理】

利用吸附柱提取RNA 作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA 鏈；然后

在DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。經(jīng)熒光素

標記的探針與擴增的DNA 雜交，利用DNA 聚合酶的5′→3′外切酶活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，

發(fā)出特異性熒光信號；利用熒光PCR 儀檢測特異性熒光信號，并根據(jù)樣品Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結(jié)

果。

【主要組成成份】

大盒

（室溫保存）

序號名稱規(guī)格（50T） 序號名稱規(guī)格（50T）

1 裂解液35mL 5 洗脫液1mL×2

2 BME 400μL 6 吸附柱和收集管52 套

3 異丙醇35mL 7 8 聯(lián)PCR 反應管7 條

4 洗滌液35mL×2

小盒

（-20℃保存）

8 陰性對照1mL 10 RT-PCR 反應液A 558μL×2

9 陽性對照1mL 11 RT-PCR 反應液B 80μL

【儲存條件及有效期】

儲存條件詳見【主要組成成份】，本試劑盒有效期為6 個月。

【適用儀器及材料】

1. 設(shè)備：分析天平、離心機（12000 轉(zhuǎn)/分鐘）、熒光PCR 儀、-20℃冰箱。

2. 器材：眼科剪、眼科鑷、組織研磨器（研缽或勻漿器）、一次性注射器、可調(diào)移液器（2.5μL、20μL、200 μL、

1000 μL）、計時器。

3. 耗材及試劑：生理鹽水、無RNA 酶的1.5 mL 離心管和吸頭（10μL、200 μL、1000 μL）、滅菌蒸餾水。

【樣品要求】

1. 病死或撲殺的豬，取肺、扁桃體和腦等組織。

2. 待檢活豬，用注射器取血5 mL。

3. 立即檢測或短期內(nèi)2～8 ℃保存，避免反復凍融。

【檢驗方法】

一、樣品制備

1. 組織樣品的處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g 于研磨器中磨碎，

再加1mL 生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心2 min，取200 μ

L 上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2. 全血樣品的處理：待血凝后取200 μL 血清于1.5 mL 滅菌離心管中。

3. 陽性對照的處理：混勻后，8000rpm 離心2min，取200 μL 上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

4. 陰性對照的處理：取200 μL 于1.5 mL 滅菌離心管中。

二、病毒RNA 的提取

1. 往裂解液中加入BME 340μL，充分混勻。（加入了BME 的裂解液須置于4℃保存）

2. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600μL 裂解液，上下顛倒混勻8～10 次，室溫靜置10min 。

3. 加入600μL 異丙醇，上下顛倒混勻5 次。

4. 吸取650μL 混合液轉(zhuǎn)入吸附柱，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。

5. 重復步驟4。

6. 向吸附柱中加入600μL 洗滌液，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。

7. 重復步驟6。

8. 空柱12,000 rpm 離心2 min。

9. 將吸附柱移入新的無RNA 酶的1.5 mL 離心管中，在吸附柱膜中央加入25μL 洗脫液，室溫靜置1min，12,000 rpm

離心45s，獲得總RNA。立即檢測或-20℃保存。

三、實時熒光RT-PCR

1. 反應體系配制：每份總體積25 μL，按下表配制，充分混勻，并作好標記。

試劑用量

RT-PCR 反應液A 21μL

RT-PCR 反應液B 1.5μL

模板RNA 2.5μL

2. 反應程序：在熒光PCR 儀上進行以下反應：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3min；循環(huán)95 ℃ 5 s，58℃ 40 s，共40 次，

在每次循環(huán)第二步（58℃ 40s）收集FAM 熒光信號（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）。

【參考值】陽性對照Ct 值≤30.0 且出現(xiàn)典型擴增曲線，陰性對照無Ct 值或Ct 值=40 時，實驗成立。

【檢驗結(jié)果的解釋】

1 結(jié)果分析條件設(shè)定

閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對照擴增曲線的zui高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。

2 結(jié)果描述及判定

當被檢樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線且Ct 值≤30.0 時為豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性，無Ct 值為豬繁殖與呼吸綜合征

病毒陰性；對于Ct 值＞30.0 的樣品，應重檢，Ct 值＞38.0 的樣品判為陰性，Ct 值≤38.0 的樣品判為陽性。

【注意事項】

1．各試劑須在規(guī)定的溫度儲存。

2．本試劑盒有效期為6 個月，不要使用超過有效期的試劑。

3. 嚴格遵守說明書操作，可以獲得的實驗結(jié)果，移液、定時等全部過程必須。

4．保存于-20℃的試劑使用前須完全融化，并充分混勻，8000rpm 離心15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸

取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20℃。

5. 反復凍融試劑將降低檢測的靈敏度，建議3 次內(nèi)用完。

6．注意防止試劑盒組份受污染，不同試劑盒之間的組份不要混用。

7．RNA 提取過程中，須戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間，避免RNA 酶污染。

8. BME 含有對人體有害的物質(zhì)，室溫下避光保存，且避免直接接觸。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：北京威瑞谷生物科技有限公司 地址：北京市平谷區(qū)南樂鎮(zhèn)

：， ：0316—8365461

電郵： 郵編：065300

【說明書批準及修改日期】2015 年01 月01