IP組織細胞蛋白裂解液是一種在非變性條件下裂解細胞和組織的裂解液。能裂解細胞并充分釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。裂解蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能。...

IP細胞裂解液

 

產(chǎn)品編號：HR0265

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

裂解液2-8℃保存；蛋白酶抑制劑-20℃保存，有效期1年。

產(chǎn)品簡介：

IP組織細胞蛋白裂解液是一種在非變性條件下裂解細胞和組織的裂解液。能裂解細胞并充分釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。裂解蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能。

本裂解液裂解的細胞和組織樣本，主要用于免疫沉淀和免疫共沉淀等。

本裂解液不含有離子型去垢劑組分，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白之間原有的相互作用的破壞，提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白，下游應(yīng)用范圍廣，提取液裂解細胞的能力較溫和，需要根據(jù)實際樣本情況優(yōu)化裂解時間。

IP細胞裂解液適用樣本：

● 細胞 ● 組織

產(chǎn)品特點：

● 使用方便，從細胞，組織提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

● 提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

● 總蛋白提取液含多種有效成分，可充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

 

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機 ● 振蕩器 ● 勻漿機/勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS緩沖液

● 蛋白定量試劑盒

注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 如果試劑盒不能短時間內(nèi)用完，蛋白酶抑混合物不可以一次加入提取液。

● 可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

使用方法：

A、細胞裂解

1、裂解液制備：

每1mL冷的IP蛋白裂解液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測定某些細胞內(nèi)蛋白酶、磷酸酶活性等下游實驗時，注意根據(jù)實際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

2、取5-10×10⁶個細胞，在4℃，1000×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞。

【注】：

● 細胞可以收集后裂解，也可以直接原位裂解，根據(jù)操作習(xí)慣選擇。

3、用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、每5×10⁶個細胞中加入500μL冷的裂解液，混勻后，在4℃條件下振蕩15-20分鐘。

【注】：

● 每10⁶個細胞，大約10mg或10μL沉淀，加入100μL裂解液。大約相當于6孔板的每孔加入100μL-150μL，或1個75cm²培養(yǎng)瓶加1mL。裂解液和細胞應(yīng)充分接觸。如果裂解液不足量，細胞裂解效率將會降低。

5、在4℃，12000-14000×g條件下離心15分鐘。

6、快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實驗。

B、組織裂解

1、裂解液制備：

每1mL冷的IP蛋白裂解液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測定某些細胞內(nèi)蛋白酶、磷酸酶活性等下游實驗時，注意根據(jù)實際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

2、取100mg組織樣本用手術(shù)剪刀剪碎，加入1mL裂解液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。

【注】：

● 如果組織樣品很細小，可剪碎后直接加入提取液振蕩15分鐘，可以不用勻漿器。

● 一般按組織：提取液用量1:10（w/v）左右加入提取液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將組織：提取液用量比例調(diào)整為1:5.

● 也可用液氮研磨的方法。

3、將組織勻漿液在4℃振蕩15-25分鐘。

4、在4℃，12000-14000×g條件下離心15分鐘。

5、快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實驗。

上述蛋白提取物可分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。

● 蛋白蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

IP細胞裂解液常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全,導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理,沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 細胞裂解速度慢？

為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用獨特的保護蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應(yīng)用范圍廣。適當延長裂解的時間即可。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準。如果已經(jīng)進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取時出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下,可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗即可；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理,300w/10秒間隔10秒,超聲3分鐘,隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NF-kappaB、p53等時,不必進行超聲處理。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

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