細胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)是高品質(zhì)的探針標記及檢測產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多細胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)等探針標記及檢測產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括細胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：細胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)
英文名稱：Intracellular pH fluorescence probe
產(chǎn)品貨號：YT357
產(chǎn)品規(guī)格：50微升

本品是zuì常用的檢測細胞內(nèi)pH的熒光探針，用于細胞內(nèi)pH檢測時，常用的BCECF AM的濃度為1-10μM。本BCECF AM(pH熒光探針)是配制于無水DMSO(anhydrous DMSO)中的儲存液，濃度為5mM。

BCECF AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。BCECF AM沒有熒光，進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成BCECF，從而被滯留在細胞內(nèi)。BCECF在適當?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。zuì大激發(fā)波長和發(fā)射波長因pH的不同而有所不同，zuì大激發(fā)波長大致在503nm左右，zuì大發(fā)射波長大致在520nm左右，實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為535nm。BCECF在不同pH條件下的發(fā)射光譜參考下圖。



BCECF AM不僅被廣泛用于哺乳動物細胞的研究，也有報道用于動物組織、植物細胞、細菌和酵母等的細胞內(nèi)pH水平檢測。在有細胞內(nèi)pH變化的細胞毒性、細胞凋亡、細胞粘附、藥物抵抗、細胞趨化等過程中BCECF AM被廣泛應(yīng)用。

注意事項：
1. BCECF AM(pH熒光探針, 5mM)可能對人體有害，請注意適當防護。
2. 本BCECF AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
3. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

儲存條件：-20℃，有效期12個月。

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名稱：PCR法DNA探針標記試劑盒
貨號：BTN90604A
規(guī)格：5次
PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標記反應(yīng)的模板和設(shè)置對照反應(yīng))和5次50μl體系的標記反應(yīng)。
3.一次標記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和地gāo辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標記的PCR產(chǎn)物。
二：非標記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標記PCR。
三：標記PCR反應(yīng)(zuì好做一個不加標記的對照用于定量)
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，這種復(fù)性會與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標記：探針引物一和引物二 單鏈標記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補到50μL	補到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經(jīng)進過優(yōu)化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對擴增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應(yīng)和對照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，地gāo辛等)、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產(chǎn)物(但同位素標記不能用此法)。
 注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強弱不能準確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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貨號	名稱	規(guī)格
BTN130997	Sephadex G50介質(zhì)	10mL
BTN90605C	TdT加尾法DNA地gāo辛標記試劑盒	5次
BTN100921	地gāo辛標記dUTP溶液(Digoxin-11-dUTP)	25μL
BTN90603A	隨機引物法DNA探針標記試劑盒	5次
BTN90603B	隨機引物法DNA探針生物素標記試劑盒	5次
BTN8091	超級雜交液(不含甲酰胺)	100mL
BTN130906	超級雜交液(原位雜交)	10mL

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