惡性瘧原蟲(chóng)單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑是高品質(zhì)的細(xì)菌PCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，惡性瘧原蟲(chóng)單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑是我司眾多優(yōu)質(zhì)細(xì)菌PCR檢測(cè)試劑盒之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購(gòu)。...

特別提示：包括惡性瘧原蟲(chóng)單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：惡性瘧原蟲(chóng)單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：SYA123
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒

一、簡(jiǎn)介：
本試劑盒用一對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用熒光PCR 探針技術(shù)進(jìn)行惡性瘧原蟲(chóng)的檢測(cè)。

二、用途：
本試劑盒可用于惡性瘧原蟲(chóng)檢測(cè)鑒定及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置，還可用于惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)境監(jiān)測(cè)、衛(wèi)生檢疫及感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)

組份	數(shù)量	規(guī)格
惡性瘧原蟲(chóng)熒光PCR反應(yīng)液(qPCR MIX)	1管	672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(DNA Polymerase MIX)	1管	48μL/管
陰性對(duì)照(NTC)	1管	50μL/管
惡性瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照(PTC)	1管	50μL/管

四、熒光PCR 儀器適用范圍
ABI 系列，Bio-Rad 系列，Roche 系列等熒光定量PCR 檢測(cè)儀等。

五、儲(chǔ)存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期為6個(gè)月。

六、實(shí)驗(yàn)操作步驟
6.1 標(biāo)本采集
血液：用一次性無(wú)菌5ml 注射器抽取疑似人或動(dòng)物血3-5ml，置于枸櫞酸鈉或EDTA2Na 抗凝管中，搖勻送檢。
肺臟等組織：取上述組織1g左右，置于1.5ml潔凈EP管中送檢。
乳液、體液等標(biāo)本：取相應(yīng)標(biāo)本3-5ml，轉(zhuǎn)至1.5ml潔凈EP管中送檢。
6.2 DNA提取
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說(shuō)明進(jìn)行DNA核酸的粗提。也可采購(gòu)北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過(guò)柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。
血液樣本：直接取200μl 抗凝血，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml 離心管中，加入1ml 雙蒸水，劇烈震蕩30s，8000rpm 離心5min，棄上清，至無(wú)明顯紅色沉淀。(若沉淀明顯，請(qǐng)?jiān)僦貜?fù)上述步驟一次)。加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13000rpm 離心5min，棄上清。沉淀加入50μl 核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
肺、淋巴結(jié)等固體組織：剪取約0.1g 組織，用生理鹽水洗去血污，剪碎加入0.5mL TE 轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。將勻漿液50μl 轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管中，加入50μl 核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
乳液等液體標(biāo)本：取標(biāo)本2-3mL，13000rpm 離心3min，棄上清，沉淀加入50μl 核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
 注：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無(wú)需提取)，直接取5μL 加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽(yáng)性對(duì)照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽(yáng)性對(duì)照。

七、檢測(cè)步驟：
7.1 PCR 擴(kuò)增
從試劑盒中取出熒光PCR 反應(yīng)液(惡性瘧原蟲(chóng)-qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設(shè)所需要的PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑	每個(gè)反應(yīng)加入的量	N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液	14μL	N×14μL
酶混合液	1μL	N×1μL
總量	15μL	N×15μL

計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設(shè)定的N 個(gè)PCR 反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(PTC)5μL，10000rpm 瞬時(shí)離心10 秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:

	1循環(huán)	50℃ for 2 min
預(yù)變性	1循環(huán)	95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增	40循環(huán)	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測(cè)結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的zuì高點(diǎn)為準(zhǔn)。
8.2 試驗(yàn)成立判定
陰性對(duì)照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線。
陽(yáng)性對(duì)照(PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。
8.3 結(jié)果判定
在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽(yáng)性，表明惡性瘧原蟲(chóng)核酸陽(yáng)性。
Ct值顯示為無(wú)的樣本為陰性樣本，表明惡性瘧原蟲(chóng)核酸陰性。
如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線。如果擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則為可疑陽(yáng)性，否則判為陰性。
對(duì)于可疑陽(yáng)性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行惡性瘧原蟲(chóng)real time PCR檢測(cè)。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，判為樣本陽(yáng)性，表明惡性瘧原蟲(chóng)核酸陽(yáng)性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項(xiàng)：
(1)初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。
(2)所有使用的離心管應(yīng)高壓滅菌，而且必須不含DNA 酶。
(3)PCR 操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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