一步法Real-Time RT-由專業(yè)試劑供應(yīng)商北京百奧萊博提供，用于科研試驗(yàn)，我公司專注于核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的一步法Real-Time RT-質(zhì)量可靠，批間差小，且價(jià)格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(低含量ROX校正染料)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(低含量ROX校正染料)
英文名稱：SuperSYBR One Step RT-qPCR Kit(Low ROX)
產(chǎn)品貨號(hào)：WE0138
產(chǎn)品規(guī)格：100次

  本試劑盒是一步法Real-Time RT-qPCR專用試劑盒。所含的SYBR Green I熒光染料可以與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，使該產(chǎn)品可以用于多種不同靶序列的檢測而不需合成特異性標(biāo)記探針。使用本產(chǎn)品進(jìn)行Real Time RT-qPCR反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，避免了污染的同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)效率。全新逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。該酶逆轉(zhuǎn)錄效率高，可對(duì)少量 RNA模板進(jìn)行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。與RNA親合性高，能通讀GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。全新熱啟動(dòng)酶，在常溫下酶的活性被封閉，從而有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，大提高了熒光定量PCR反應(yīng)的性。所包含的緩沖系統(tǒng)使以上兩種酶同時(shí)發(fā)揮zuì大功效，提率。本產(chǎn)品靈敏度高，特異性高，線性范圍廣，對(duì)目的基因定量更準(zhǔn)確。

ROX染料用于校正定量PCR儀孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 擴(kuò)增儀。不同儀器的激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)有所不同，因此ROX染料的濃度必須與相應(yīng)的熒光定量PCR儀相匹配。

不需要ROX校正的儀器:(WE0137)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的儀器：(WE0138)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的儀器：(WE0139)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

試劑盒組成：

組份	WE0137-100次	WE0138-100次	WE0139-100次
2×SuperSYBR One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
SuperSYBR One Step EnzymeMix	50μl	50μl	50μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事項(xiàng)：
1、本試劑盒中的各試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。
2、本產(chǎn)品以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)，在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，建議在專門的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套，實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材應(yīng)用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃處理12小時(shí),并高壓滅菌30分鐘后使用。
3、SuperSYBR One Step RT-qPCR Buffer中含有SYBR Green I 熒光染料，保存本產(chǎn)品或配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
4、本試劑盒中的各試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。本產(chǎn)品長期保存可置于-20℃，避光。如果在短期內(nèi)需要頻繁使用，可在2～8℃保存。
5、本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來選擇，引物設(shè)計(jì)的好壞直接影響到RT-PCR反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量，引物長度，引物位置，PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。
6、本品不能用于探針法熒光定量PCR。

操作步驟：
1、將RNA模板、引物、2×SuperSYBR One Step Buffer、SuperSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2、PCR反應(yīng)體系

試劑	25μl反應(yīng)體系	終濃度
2×SuperSYBR One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
SuperSYBR One Step EnzymeMix	0.5μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(optional)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物濃度以0.2μM可以得到較好結(jié)果，可以終濃度0.1-0.5μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2)不同儀器的激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)有所不同，根據(jù)使用熒光定量的儀器選擇加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4、RT-qPCR反應(yīng)條件(熒光定量PCR為兩步法)，本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為例。

步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
反轉(zhuǎn)錄	45℃	10 min
PCR預(yù)變性	95℃	5 min
變性	95℃	10 s	30-40個(gè)循環(huán)
退火/延伸	60℃	45 s
融解曲線分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)建議采用兩步法PCR反應(yīng)程序，若提高反應(yīng)特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為設(shè)定范圍的參考；若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增。
2)融解曲線分析請(qǐng)以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進(jìn)行設(shè)定，本程序是以ABI7500熒光定量PCR儀為參照設(shè)定。

RT-qPCR反應(yīng)條件(熒光定量PCR為三步法)：

步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
反轉(zhuǎn)錄	45℃	10min
PCR預(yù)變性	95℃	5min
變性	95℃	15s	30-40 個(gè)循環(huán)
退火	56℃-64℃	30s
延伸	72℃	30s
融解曲線分析	95℃	15s
	60℃	1min
	95℃	15s
	60℃	15s

注意：
1)三步法PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度請(qǐng)以 56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。
2)融解曲線分析請(qǐng)以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進(jìn)行設(shè)定，本程序是以ABI 7500熒光定量PCR儀為參照設(shè)定。

儲(chǔ)存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
YT395	cDNA鏈合成試劑盒(RNase H-)	10次
WE0138	一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(低含量ROX校正染料)	100次
WE0142	快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混體系(低含量ROX校正染料)	5ml
WE0156	BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(高含量ROX校正染料)	5ml
ALH260	耐熱M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶	5000U|10000U
RFT164	通用型PCR試劑盒(含模版和引物)	20次

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