北京百奧萊博供應的副溶血性弧菌TDH/TLH雙重熒用于科研目的，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價位合理，需要副溶血性弧菌TDH/TLH雙重熒等細菌PCR檢測試劑盒產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括副溶血性弧菌TDH/TLH雙重熒光PCR檢測試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：副溶血性弧菌TDH/TLH雙重熒光PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品貨號：SYA101
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒



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一、簡介：
本試劑盒用一對惡性瘧原蟲特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用熒光PCR 探針技術進行惡性瘧原蟲的檢測。

二、用途：
本試劑盒可用于惡性瘧原蟲檢測鑒定及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置，還可用于惡性瘧原蟲的環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢疫及感染的輔助診斷，其檢測結果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)

組份	數(shù)量	規(guī)格
惡性瘧原蟲熒光PCR反應液(qPCR MIX)	1管	672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(DNA Polymerase MIX)	1管	48μL/管
陰性對照(NTC)	1管	50μL/管
惡性瘧原蟲陽性對照(PTC)	1管	50μL/管

四、熒光PCR 儀器適用范圍
ABI 系列，Bio-Rad 系列，Roche 系列等熒光定量PCR 檢測儀等。

五、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃保存，避免反復凍融，有效期為6個月。

六、實驗操作步驟
6.1 標本采集
血液：用一次性無菌5ml 注射器抽取疑似人或動物血3-5ml，置于枸櫞酸鈉或EDTA2Na 抗凝管中，搖勻送檢。
肺臟等組織：取上述組織1g左右，置于1.5ml潔凈EP管中送檢。
乳液、體液等標本：取相應標本3-5ml，轉(zhuǎn)至1.5ml潔凈EP管中送檢。
6.2 DNA提取
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
血液樣本：直接取200μl 抗凝血，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml 離心管中，加入1ml 雙蒸水，劇烈震蕩30s，8000rpm 離心5min，棄上清，至無明顯紅色沉淀。(若沉淀明顯，請再重復上述步驟一次)。加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13000rpm 離心5min，棄上清。沉淀加入50μl 核酸提取液(使用前請室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl 進行PCR 反應。
肺、淋巴結等固體組織：剪取約0.1g 組織，用生理鹽水洗去血污，剪碎加入0.5mL TE 轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。將勻漿液50μl 轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管中，加入50μl 核酸提取液(使用前請室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl 進行PCR 反應。
乳液等液體標本：取標本2-3mL，13000rpm 離心3min，棄上清，沉淀加入50μl 核酸提取液(使用前請室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl進行PCR 反應。
 注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL 加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 PCR 擴增
從試劑盒中取出熒光PCR 反應液(惡性瘧原蟲-qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設所需要的PCR 反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：

試劑	每個反應加入的量	N個反應加入的量
熒光PCR反應液	14μL	N×14μL
酶混合液	1μL	N×1μL
總量	15μL	N×15μL

計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設定的N 個PCR 反應管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(PTC)5μL，10000rpm 瞬時離心10 秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:

	1循環(huán)	50℃ for 2 min
預變性	1循環(huán)	95℃ for 10 min
PCR擴增	40循環(huán)	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果?；€和閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
陰性對照(NTC)：不應產(chǎn)生任何的擴增曲線。
陽性對照(PTC)：均產(chǎn)生擴增曲線。
以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明惡性瘧原蟲核酸陽性。
Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明惡性瘧原蟲核酸陰性。
如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行惡性瘧原蟲real time PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明惡性瘧原蟲核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
(1)初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
(2)所有使用的離心管應高壓滅菌，而且必須不含DNA 酶。
(3)PCR 操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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