Taq稀釋緩沖液是高品質(zhì)的核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于科學(xué)研究，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價(jià)格，深為用戶稱道，了解更多Taq稀釋緩沖液等核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品請(qǐng)聯(lián)系我司咨詢訂購(gòu)。...

特別提示：包括Taq稀釋緩沖液在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：Taq稀釋緩沖液
產(chǎn)品貨號(hào)：GL1302
產(chǎn)品規(guī)格：100ml

用途：
Taq稀釋液

注意事項(xiàng)：
主要由Tris-HCl、EDTA、NP40組成。

儲(chǔ)存條件：室溫，12個(gè)月

根據(jù)您的關(guān)注的Taq稀釋緩沖液，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：



名稱：T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒
貨號(hào)：BTN91108
規(guī)格：50次
本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA聚合酶的RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有T3啟動(dòng)子的模版DNA，以NTP為底物，從T3啟動(dòng)子下游開始合成與模板DNA中一條鏈互補(bǔ)的RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的RNA分子。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需提供含T3啟動(dòng)子的DNA模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需耍單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模板DNA可以是線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.可以合成的RNA的zuì佳長(zhǎng)度在20nt到5000nt之問。
5.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX技術(shù)和RNA干擾(RNAi)等實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液(2×)	0.5mL
陽(yáng)性對(duì)照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
說明書	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制備DNA模板
PCR片段和質(zhì)粒DNA都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)：
1)必須使用線性化的DNA。如果是質(zhì)粒DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。
2)是需要轉(zhuǎn)錄的DNA序列的上游必須有T3啟動(dòng)子。如果模板是PCR產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將T3啟動(dòng)子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是將DNA片段克隆到載體上，則需要選擇有T3啟動(dòng)子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于T3啟動(dòng)子下游。
3)是需要轉(zhuǎn)錄的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如選擇了Pst I來線性化質(zhì)粒)，則zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必須保證DNA模板中沒有RNase。由于提取質(zhì)粒DNA的過程中一般要使用大量的RNase A，因此質(zhì)粒DNA一般都有嚴(yán)重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒DNA。并且加入少量總RNA一起保溫，然后電泳檢測(cè)RNA是否被降解，以此判斷純化的DNA模板是否有殘留RNase A。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1.在一個(gè)RNase-free的塑料離心管中，在室溫下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	備注
DNA模板	xμl	總量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建議用50ng左右；如果模板是質(zhì)粒DNA，建議用1μg左右；如果用本產(chǎn)品提供的陽(yáng)性對(duì)照，建議用4μL)
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液，2×	10μl	需室溫時(shí)使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分還含其他促進(jìn)劑，所以是混合物
RNase-free水	補(bǔ)水到20μL

注：此為20μL反應(yīng)體系的用量，對(duì)其他體積的反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標(biāo)記RNA探針，則需要定做NTP分開而不是NTP預(yù)先混合的試劑盒。如果需要得到加帽RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸(本公司有各種加帽修飾核苷酸)。
2. 37℃保溫1-2小時(shí)。注意：延長(zhǎng)保溫時(shí)間并不能提高產(chǎn)量。
3. 70℃加熱10分鐘滅活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需進(jìn)一步去除DNA模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購(gòu)買，本試劑盒不提供。
1.在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入3-5U自備的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保溫15-30分鐘。
3. 補(bǔ)水到100μL，
4. 用自備的等體積(100μL)的Tris飽和酚-lǜ仿抽提一次去除殘留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自備的微量核酸沉淀劑(BTN50903；用前需要搖晃混勻)，振蕩后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震蕩10秒后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。
8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA?？扇苡赗Nase-free水中后立即使用或放-80℃長(zhǎng)期保存。

疑難解答：
1、沒有RNA產(chǎn)物。zuì常見原因是DNA模板有RNase污染，測(cè)試方法是用純化的RNA跟模板DNA一起保溫，再檢測(cè)RNA是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染嚴(yán)重，可能需要用戶補(bǔ)加RNase inhibitor。
2、RNA產(chǎn)量低。zuì常見的原因是DNA模板序列。在轉(zhuǎn)錄序列的個(gè)和第二個(gè)堿基zuì好都是G，在前14個(gè)堿基內(nèi)避免有U存在。
3、RNA長(zhǎng)度比預(yù)期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的終止序列。可以改用SP6或T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(啟動(dòng)子也必須改成SP6或T7啟動(dòng)子)。
4、RNA長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果RNA長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)很多，使用的模板又是質(zhì)粒DNA，則可能是質(zhì)粒DNA線性化不徹底。
5、5′單磷酸還是三磷酸。如果使用GTP，則得到的RNA是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長(zhǎng)(如12小時(shí))，則有50%的三磷酸會(huì)變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入GMP，則T3 RNA聚合酶將優(yōu)先使用GMP，所得RNA產(chǎn)物中5′端是單磷酸的比例將大大增加。

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
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WE0132	cDNA鏈合成試劑盒	100次
WE0151	快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR的預(yù)混體系(熒光探針)	1ml|5ml

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