快速DNA連接試劑盒由專業(yè)試劑供應(yīng)商北京百奧萊博提供，用于科研試驗(yàn)，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要快速DNA連接試劑盒等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括快速DNA連接試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：快速DNA連接試劑盒
英文名稱：Rapid DNA Ligation Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：YT028
產(chǎn)品規(guī)格：100次|500次

本試劑盒是百奧萊博的一種把DNA片段在短至5-10分鐘內(nèi)快速插入到載體中的連接試劑盒。對(duì)于雙粘端DNA片段的插入僅需5-10分鐘即可完成，對(duì)于雙平端DNA片段的插入僅需15分鐘即可完成。同時(shí)本試劑盒也可以用于其它各種常規(guī)的雙鏈DNA連接反應(yīng)。連接30分鐘即可達(dá)到zuì佳效果，與連接過(guò)夜的效果一致。

本試劑盒可以用于PCR片段和載體的連接、酶切產(chǎn)物和載體的連接、linker和載體的連接、linker和linker的連接等各種雙鏈DNA的連接。

為了獲得快速的連接效果，本試劑盒采用了一種特殊的高活力Rapid T4 DNA Ligase以及相應(yīng)的快速連接緩沖液，確保在短時(shí)間內(nèi)可以獲得很好的連接效果。連接30分鐘和連接過(guò)夜的效果相當(dāng)，通常只須連接5-10分鐘即可滿足常規(guī)用途。（如下圖）


快速DNA連接試劑盒實(shí)測(cè)效果圖。雙酶切后的載體室溫自連30min(A)或16℃自連過(guò)夜(D)作為陰性對(duì)照；雙酶切后的載體與待插入片段室溫連接10min(B)、30min(C)或者16℃連接過(guò)夜(E)，隨后轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂板，并于第二天取平板觀察拍照。

在確保連接效果的同時(shí)，確保完成連接后不必進(jìn)行任何純化即可直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌。另外，快速連接緩沖液中已經(jīng)含有ATP、鎂離子等各種必需物質(zhì)，無(wú)需再添加其它任何試劑。本試劑盒用于總體積為10μl的連接體系時(shí)可以進(jìn)行100個(gè)連接反應(yīng)，用于總體積為20μl的連接體系時(shí)可以進(jìn)行50個(gè)連接反應(yīng)。

注意事項(xiàng)：
1. 連接反應(yīng)完成后即可直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌，請(qǐng)勿采用加熱方法失活Rapid T4 DNA ligase。加熱處理會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的轉(zhuǎn)化效率顯著下降。
2. 對(duì)于載體單酶切插入外源片段的情況，需注意對(duì)載體進(jìn)行脫磷處理，以避免質(zhì)粒自連。
3. 快速連接緩沖液(2X)使用前一定要完全溶解并混勻，加入到連接體系后也須注意混勻。

儲(chǔ)存條件：-20℃。

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
ZN0293	CK1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0332	CRISP1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0392	Decorin mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0718	IKKβ/IKB Kinaseβ mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0724	IL13RA2 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0761	Interferon-γ/IFN-γ mRNA原位雜交試劑盒	100T

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名稱：Adora2b mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0033
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：rat
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.Adora2b mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過(guò)氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過(guò)夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過(guò)4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)2小時(shí)。某些組織對(duì)過(guò)度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過(guò)1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
Adora2b的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過(guò)不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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