肺炎克雷伯菌單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研目的，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要肺炎克雷伯菌單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試等細(xì)菌PCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的客戶(hù)，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括肺炎克雷伯菌單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱(chēng)：肺炎克雷伯菌單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：SYA037
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒



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貨號(hào)：SYA050
規(guī)格：48次/盒

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貨號(hào)：SYA080
規(guī)格：48次/盒
本試劑盒適用于增菌培養(yǎng)物、疑似病料及食品中大腸桿菌O157的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。

出血性大腸桿菌(EHEC O157)可引起人的出血性腹瀉和腸炎的大腸埃希氏菌，引發(fā)人類(lèi)、家畜以及野生禽獸不同形式的疾病。本方法為熒光PCR檢測(cè)方法，反應(yīng)在同一管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，并有效防止了污染，能對(duì)樣品中或預(yù)培養(yǎng)液中的大腸桿菌O157進(jìn)行快速檢測(cè)，具有特異性高、敏感性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。O157的探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為None。

試劑盒組成：

組份	數(shù)量	規(guī)格
大腸桿菌O157熒光qPCR反應(yīng)液(O157-qPCR MIX)	1管	720μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
陰性對(duì)照(NTC)	1管	50μL/管
陽(yáng)性對(duì)照(O157-PTC)	1管	50μL/管

儲(chǔ)存條件：-20℃以下，有效期6個(gè)月。

使用方法：

一、樣品采集：
?食品樣品：樣品的采集與預(yù)培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn) (GB/T 4789.36-2008) 要求進(jìn)行。
?糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
?病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
 注：上述樣品建議經(jīng)過(guò)增菌后，收集培養(yǎng)物用于檢測(cè)。

二、DNA提?。?/strong>
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說(shuō)明進(jìn)行DNA核酸的粗提。也可采購(gòu)北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過(guò)柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。
?液體培養(yǎng)物：取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
?固體培養(yǎng)物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
?糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
?其他液體標(biāo)本：取標(biāo)本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 注：建議采用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行前增菌，并按照液體培養(yǎng)物方法進(jìn)行提取。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無(wú)需提取)，直接取5μL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽(yáng)性對(duì)照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽(yáng)性對(duì)照。

三、檢測(cè)步驟：
1．試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光qPCR反應(yīng)液(O157-qPCR MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑	每個(gè)反應(yīng)加入的量	N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液	15μL	N×15μL

向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品/陰性對(duì)照(NTC)/陽(yáng)性對(duì)照(O157-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
2．qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。推薦循環(huán)條件：

	1循環(huán)	50℃ for 2 min
預(yù)變性	1循環(huán)	95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增	40循環(huán)	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM，淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

四、結(jié)果分析：
1．結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測(cè)結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的zuì高點(diǎn)為準(zhǔn)。
2．試驗(yàn)成立判定
?陰性對(duì)照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線。
?陽(yáng)性對(duì)照(O157-PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。
?以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。
3．結(jié)果判定
?在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽(yáng)性，表明O157核酸陽(yáng)性。
?Ct值顯示為無(wú)的樣本為陰性樣本，表明O157核酸陰性。
?如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線。如果擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則為可疑陽(yáng)性，否則判為陰性。
?對(duì)于可疑陽(yáng)性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行O157 qPCR檢測(cè)。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，判為樣本陽(yáng)性，表明O157核酸陽(yáng)性；否則判為樣本陰性。

五、注意事項(xiàng)：
?初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。
?所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
?PCR操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
?樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
?試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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