北京百奧萊博供應(yīng)的快速定點(diǎn)突變試劑盒用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，快速定點(diǎn)突變試劑盒是我司眾多優(yōu)質(zhì)基因結(jié)構(gòu)和功能之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括快速定點(diǎn)突變試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：快速定點(diǎn)突變試劑盒
英文名稱：Fast Site-Directed Mutagenesis Kit
產(chǎn)品貨號：WH0118
產(chǎn)品規(guī)格：20次

體外定點(diǎn)突變技術(shù)是當(dāng)前生物、醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域研究中的一種重要實(shí)驗(yàn)手段，多用于改造、優(yōu)化目的基因；探索啟動子的調(diào)節(jié)位點(diǎn)；以及研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系。本試劑盒采用目前技術(shù)，可在目標(biāo)載體上直接對靶基因進(jìn)行單點(diǎn)突變，多點(diǎn)突變及插入或缺失突變，并且單點(diǎn)突變的突變率可達(dá)90%以上。另外，與以往的突變試劑盒需要多輪PCR及亞克隆等耗時(shí)耗力的步驟不同，本試劑盒的操作更為簡便，從未突變菌株到突變菌株的構(gòu)建只需要4步，如下圖所示：


試劑盒提供的FastAlteration DNA Polymerase是一種快速高保真DNA聚合酶，該酶保真性能優(yōu)良，靈敏度高，擴(kuò)增速度可達(dá)15~30 sec/kb，并且zuì高可擴(kuò)增長度為10 kb的質(zhì)粒DNA。試劑盒附帶的FDM感受態(tài)細(xì)胞具有體內(nèi)降解甲基化質(zhì)粒的功能，可以對未被Dpn I降解掉的質(zhì)粒模板進(jìn)行進(jìn)一步的降解，因此可以保證試劑盒具有更高的陽性率。同時(shí)，本試劑盒還為客戶提供了對照質(zhì)粒和引物，方便客戶查找實(shí)驗(yàn)問題。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
·簡便快速：試劑盒采用非鏈取代式質(zhì)粒擴(kuò)增技術(shù)，只需4步即可實(shí)現(xiàn)由非突變菌株到突變菌株的轉(zhuǎn)變，而不需要多輪PCR及亞克隆等耗時(shí)耗力的步驟。
·引物：試劑盒采用部分重疊的引物設(shè)計(jì)原則，可以擴(kuò)增得到更多的突變質(zhì)粒。
·應(yīng)用廣泛：本試劑盒不但可進(jìn)行單點(diǎn)突變，還可以進(jìn)行多點(diǎn)突變，且突變點(diǎn)數(shù)可達(dá)5個(gè)。
·適應(yīng)性強(qiáng)：本試劑盒zuì大可對10 kb的質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，基本覆蓋所有常用質(zhì)粒。
·突變率高：本試劑盒具有體外和體內(nèi)雙重消化甲基化質(zhì)粒模板的功能，可以保證更高的突變率。對于單點(diǎn)突變而言，本試劑盒的突變率可達(dá)90%以上。

適用范圍：
·改造優(yōu)化目的基因和載體；
·分析啟動子上與調(diào)控蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)；
·研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。

試劑盒組成：

組分	規(guī)格
FastAlteration DNA Polymerase（1U/μl)	20μl
5× FastAlteration Buffer	200μl
Dpn I restriction enzyme（20U/μl)	20μl
4.5 kb Control plasmid（5ng/μl)	40μl
Control primers（5μM,each)	80μl
FDM competent cells	20×50μl

儲存條件：于-20℃條件下保存。感受態(tài)細(xì)胞-70℃條件下保質(zhì)期6個(gè)月，試劑盒其他組分在-20℃條件下保質(zhì)期1年。

注意事項(xiàng)
1．在進(jìn)行單引物多位點(diǎn)突變時(shí)，由于增加了突變位點(diǎn)個(gè)數(shù)，所以突變率較單點(diǎn)突變時(shí)會有所降低，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)突變位點(diǎn)個(gè)數(shù)達(dá)到5個(gè)時(shí)，突變陽性率會降低到50%。因此建議客戶要增加驗(yàn)證的克隆子數(shù)。
2．本試劑盒支持多引物多位點(diǎn)突變，這樣可以在基因內(nèi)更廣泛的范圍內(nèi)進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)。突變位點(diǎn)個(gè)數(shù)的上限仍然是5個(gè)。
3．建議在進(jìn)行新的突變實(shí)驗(yàn)時(shí)要帶上試劑盒附帶的對照質(zhì)粒和引物，以便于對實(shí)驗(yàn)問題進(jìn)行分析。

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名稱：5′RACE試劑盒
貨號：BTN101105
規(guī)格：10次
研究真核基因的zuì基礎(chǔ)的工作之一就是確定其轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，目前zuì通用的方法是5′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman發(fā)明的、通過PCR快速克隆cDNA末端的技術(shù)，它在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過往兩端延伸和擴(kuò)增獲得其5′-端序列。本試劑盒就是根據(jù)5′-RACE原理而開發(fā)。RACE的原理如下圖：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 即開即用，客戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備各種材料。
2.反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，包括使用無RNase H活性的MMLV和優(yōu)化的引物。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	60μl
微量核酸沉淀劑	400μl
TdT(末端轉(zhuǎn)移酶)	10μl
2×TdT Buffer(含dATP)	100μl
PCR MagicMix 3.0	1.5ml
5′-RACE引物A-引物B混合液	100μl
5′-RACE引物C	100μl
RNase-Free水	1ml

儲存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

1.變性模板RNA：將1μg mRNA或5μg總RNA加入到一個(gè)RNase-free的PCR管中，補(bǔ)RNase-Free水到9μL，65℃保溫5分鐘后短暫離心，立即放冰上待用。如果RNA濃度偏低，體積超過9μl,可以使用本公司的核酸濃縮劑(需另購,產(chǎn)品編號為BTN110801)濃縮到所需的體積。
2. 設(shè)置RT反應(yīng)(用戶可以根據(jù)需要設(shè)陰性對照)：在上步的含變性后的RNA模板的PCR管中，按順序加入：

成分	用量
自備的基因?qū)Ｒ恍砸顰(10μM)	4μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	6μl
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合液	1μl
合計(jì)	20μl

3. 37℃保溫60分鐘，42℃保溫30分鐘，50℃保溫10分鐘，zuì后75℃保溫10分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶變性。
4. 短暫離心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀劑(本產(chǎn)品含不溶的核酸助沉劑，用前需要充分搖勻再取用)，震蕩混勻。
6.室溫12000rpm離心15分鐘，小心吸棄上清。
7. 加入1mL自備75%乙醇，室溫12000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清。
8. 短暫離心數(shù)秒，小心吸棄殘留液體后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：為保證加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水zuì好不要超過10μl。
9. 加尾反應(yīng)：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，輕柔吹打混勻。
10. 37℃保溫15分鐘進(jìn)行加尾反應(yīng)，然后75℃保溫3分鐘滅活末端轉(zhuǎn)移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀釋加尾反應(yīng)體系。此稀釋液將作為PCR的模板。
12. 輪PCR：用不同量的稀釋后的加尾反應(yīng)液設(shè)置PCR反應(yīng)(樣品組zuì好設(shè)用量梯度，單位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
PCR MagicMix 3.0	25	25	25	25
自備基因?qū)Ｒ恍砸顱(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
5′RACE引物 A-引物B混合液	2.5	2.5	2.5	2.5
稀釋后的加尾反應(yīng)液	1	5	10	15
RNase-free 水	19	15	10	5
合計(jì)	50	50	50	50

13. 按下列條件進(jìn)行 PCR(注：應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?。
 第1次循環(huán)：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
 第2-30次循環(huán)：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
 zuì后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳電泳檢查PCR結(jié)果，如果一條清晰的條帶，則可以不做后續(xù)的第二輪PCR，而直接進(jìn)行 DNA 測序或TA克隆。
15. 第二輪PCR：如果輪PCR沒有一條清晰的條，則帶從4管PCR產(chǎn)物中各取1μL分別加入到20μL RNase-free水中進(jìn)行稀釋，然后各取1μL分別作為4管第二輪PCR的模板：

成分	用量
輪 PCR產(chǎn)物的稀釋液	1μl
PCR MagicMix 3.0	25μl
5′RACE引物 C	2.5μl
自備基因?qū)Ｒ恍砸?C(10μm)	2.5μl
RNase-free 水	補(bǔ)水至50μl
合計(jì)	50μl

16. 按下列條件進(jìn)行 PCR：第 1-30次循環(huán)(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，zuì后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二輪 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，一般都會有一個(gè)樣品有清晰的條帶出現(xiàn)，則可以直接進(jìn)行DNA測序或TA克隆。

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