本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 M-CSF 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 M-CSF與單抗結合，加入生物素化的抗人M-CSF，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，M-CSF濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中M-CSF濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
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酶標板（Coated Wells） |
96孔 |
酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate） |
12ml |
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10×標本稀釋液（Sample Buffer） |
12ml |
20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） |
50ml |
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標準品（Standards）：20ng/瓶 |
2瓶 |
底物工作液（TMB Solution） |
12ml |
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抗體工作液（Biotinylated Antibody） |
12ml |
終止液（Stop Solution） |
12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。
2. 標準品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設標準管8管，管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
結果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2. 以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應M-CSF含量。
試劑盒性能
1. 靈敏度：小的M-CSF 檢測濃度小于16.5pg/ml。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的人M-CSF。不與人其它細胞因子有交叉反應。
3. 重復性：板內、板見變異系數(shù)均小于10.3％。
注意事項
1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
2. 洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致度誤差及OD值錯誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！
