細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子MitoSOX紅色熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書
 
主要用途
 
細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子MitoSOX紅色熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑MitoSOX，在線粒體氧化損傷條件下，產(chǎn)生紅色熒光，來檢測細胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的?？梢员挥糜诩毎蛲?、信號傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。
 
技術(shù)背景
 
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細胞衰老或凋亡。其中線粒體氧化磷酸化副產(chǎn)物之一是超氧陰離子，為線粒體內(nèi)主要的活性氧族，與心血管疾病，包括高血壓、冠狀動脈硬化、糖尿病相關(guān)的血管疾病、神經(jīng)退行性疾?。ò徒鹕习Y、阿茨罕默癥、肌萎縮硬化癥）相關(guān)。MitoSOX是一種完全自由通過細胞膜，并選擇性在活體細胞線粒體內(nèi)長期滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此證明細胞線粒體內(nèi)超氧陰離子活性氧族的存在。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
清理液（Reagent A）    毫升
染色液（Reagent B）    微升
稀釋液（Reagent C）    毫升
保存液（Reagent D）    毫升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
 
用戶自備
 
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細胞脫離
完全細胞培養(yǎng)液（HL12052）：用于細胞操作所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器
1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
血細胞計數(shù)儀：用于細胞計數(shù)
臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器
細胞流式儀：用于細胞熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細胞
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析
 
實驗步驟
 
?間接法
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
 
?準備1瓶25cm2細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞
?小心抽去細胞培養(yǎng)液
?加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
?小心抽去清理液（Reagent A）
?加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
?置入37℃培養(yǎng)箱1分種
?振動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
?加入4毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
?移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
?移取10微升在血細胞計數(shù)儀上進行細胞計數(shù)
?移出1 X 106細胞到新的15毫升錐形離心管
?放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
?小心抽去上清液
?加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
?放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
?放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
?小心抽去上清液
?加入預(yù)冷的xx微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群
?放進冰槽里
?選擇下列方式之一進行操作：
?即刻進行細胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細胞以上――
波峰右移，表明超氧陰離子含量高
 
?或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長510nm，散發(fā)波長580nm――
紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
 
?或使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿
2）加入xx微升保存液（Reagent D）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長510nm，散發(fā)波長580nm――
RFU增高，表明超氧陰離子含量高
 
?直接法
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
 
1．準備1個細胞培養(yǎng)24孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％
（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項5）
2．小心抽去細胞培養(yǎng)液
3．小心沿著孔壁加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的
染色工作液到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4．放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
5．小心抽去含有染色工作液 
6．小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent D）到細胞培養(yǎng)孔
7．選擇下列方式之一進行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
激發(fā)波長510nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
 
?使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀：激發(fā)波長510nm，散發(fā)波長580nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高
 
注意事項
 
?本產(chǎn)品為20次（1毫升體系）或40次（0.5毫升體系）操作
?操作時，須戴手套
?孵育時，避免光照
?本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：
 
操作容器 操作用量
載玻片 100微升
載玻片培養(yǎng)皿 1毫升
35mm培養(yǎng)皿 1毫升
96孔培養(yǎng)板 100微升
48孔培養(yǎng)板 200微升
24孔培養(yǎng)板 500微升
12孔培養(yǎng)板 1毫升
6孔培養(yǎng)板 2毫升
25cm2細胞培養(yǎng)瓶 3毫升
 
?根據(jù)細胞類型，調(diào)整染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
?建議細胞染色完成后，即刻進行細胞熒光分析
?本公司同時提供系列超氧陰離子活性氧檢測試劑產(chǎn)品
 
質(zhì)量標準
 
?本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰