導(dǎo)讀：在實(shí)驗(yàn)室，對(duì)植物ＥＬＩＳＡ試劑盒準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。所以我們一定要做好植物ＥＬＩＳＡ試劑盒在使用前的準(zhǔn)備工作。
因此，在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20min以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。
此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí)，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制。
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做好復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請(qǐng)避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
植物ＥＬＩＳＡ試劑盒試驗(yàn)的原理好像很簡(jiǎn)單，不外乎固定抗原，增加一抗、二抗和底物，間中夾雜著洗刷和關(guān)閉。然而，即使是平鋪直敘的洗刷和關(guān)閉，假如做得不太好，也有或許毀了全部試驗(yàn)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，咱們是否能獲得有意義的信息，這在很大程度上取決于成果的信噪比。布景噪音會(huì)影響您對(duì)成果的判別。
洗刷很主要
洗刷過(guò)程看似很無(wú)聊，本來(lái)很主要，由于假如未聯(lián)系的資料(如非特異聯(lián)系的抗體或檢查試劑)殘留在微孔板中，那么它會(huì)增加布景噪音。如有必要，可增加洗刷液中的鹽濃度，這會(huì)阻止非特異聯(lián)系反應(yīng)。假如布景過(guò)高，而您置疑洗刷不行時(shí)，能夠測(cè)驗(yàn)增加洗刷次數(shù)。
關(guān)閉更關(guān)鍵
關(guān)閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占有微孔板中潛在的聯(lián)系位點(diǎn)。這就下降了可發(fā)作信號(hào)的抗體非特異聯(lián)系的時(shí)機(jī)。您當(dāng)然也期望抗體只與意圖蛋白聯(lián)系吧。假如您的布景過(guò)高，置疑關(guān)閉不充分，那么您能夠測(cè)驗(yàn)運(yùn)用更高濃度的關(guān)閉液，或恰當(dāng)延伸關(guān)閉時(shí)刻。
假如您一直被布景疑問(wèn)所困擾，ELISA試劑盒那么或許您該花些時(shí)刻來(lái)優(yōu)化關(guān)閉液。這或許需求時(shí)刻，但也是值得的?，F(xiàn)在主要有兩種類型的關(guān)閉液：蛋白和非離子型去污劑。您運(yùn)用的類型須取決于多個(gè)要素，包含微孔板的外表試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢查試劑。好的關(guān)閉液應(yīng)下降非特異性聯(lián)系，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢查試劑發(fā)作相互作用。
常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種關(guān)閉液、安穩(wěn)，在去掉洗刷過(guò)程中的一些非特異聯(lián)系上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用，由于很簡(jiǎn)單被洗掉。因而一切洗刷液中也有必要增加關(guān)閉液。請(qǐng)勿運(yùn)用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會(huì)下降特異聯(lián)系，發(fā)作假陰性。另一個(gè)挑選是運(yùn)用蛋白和非離子型去污劑這兩種關(guān)閉液，后者可協(xié)助洗刷過(guò)程中的關(guān)閉。
蛋白關(guān)閉液則有所不一樣，是持久的。它們與開放位點(diǎn)聯(lián)系并關(guān)閉，同時(shí)安穩(wěn)與微孔板聯(lián)系的抗原分子。常用的蛋白關(guān)閉液包含牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組分的內(nèi)涵多樣性可使它有用阻攔很多不一樣類型的分子相互作用。不過(guò)，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。處理這個(gè)疑問(wèn)的一種辦法是運(yùn)用雞或魚的正常血清。
抗體濃度須優(yōu)化
咱們通常會(huì)留下來(lái)的操作過(guò)程，但是假如試劑稍有不一樣，則或許需求優(yōu)化抗體的量。記住，非特異的抗體聯(lián)系會(huì)增加布景。為了避免這一點(diǎn)，切勿運(yùn)用過(guò)多的一抗或二抗。
檢查試劑要適量
另一點(diǎn)也很清楚明了：切勿運(yùn)用過(guò)多的檢查試劑。假如濃度過(guò)高，或許未準(zhǔn)確稀釋，則會(huì)導(dǎo)致高布景。也不要顯色過(guò)度，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)參加停止液。
假如您的植物ＥＬＩＳＡ試劑盒意外地遇到了高布景，那么也無(wú)需太憂慮，順次檢查ELISA體系中的組分，并掃除或許存在的疑問(wèn)。盡心優(yōu)化，信任很快就會(huì)有美麗的成果。