近日，學(xué)術(shù)期刊《分子細(xì)胞》在線發(fā)表了科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院（營(yíng)養(yǎng)與健康研究院）常興研究組題為Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase 的zui新研究成果。證明可以利用TAM (Targeted-AID induced mutagenesis)基因編輯，靶向DNA上的RNA剪接順式元件，調(diào)控RNA剪接，用于研究RNA可變剪接的功能，以及用于人類遺傳疾病的治療。

真核細(xì)胞中，RNA剪接是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。據(jù)估計(jì)，超過75％的人類基因具有一種以上的mRNA剪接方式（可變剪接），其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質(zhì)。但相對(duì)于基因功能而言，對(duì)于可變剪接的生理功能，認(rèn)識(shí)還非常有限，原因主要在于調(diào)控內(nèi)源RNA剪接的實(shí)驗(yàn)手段非常有限。RNA剪接的異常也是許多疾病的直接誘因，估計(jì)35~50％的人類疾病由基因剪接異常造成。因此，無論是從學(xué)術(shù)研究或是臨床應(yīng)用的角度，都亟需開發(fā)出調(diào)控RNA剪接的基因編輯新方法。

常興研究組過去開發(fā)TAM (Targeted AID-induced mutagenesis)，也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脫氨酶AID，并且發(fā)現(xiàn)它具有兩個(gè)特點(diǎn)。先，可以在sgRNA靶向的DNA上，將C/G堿基隨機(jī)向其它堿基突變，可以用于分析腫瘤耐藥性突變及誘導(dǎo)蛋白體外進(jìn)化等；其次，在偶聯(lián)UNG抑制劑UGI后，可以在將sgRNA靶向區(qū)域中一個(gè)小窗口內(nèi)（5-6個(gè)堿基）的C向T突變 (Nature Methods, 2016)。

在這一新研究中，博士研究生袁娟娟和馬云青先注意到，98%以上的內(nèi)含子有保守的GU（內(nèi)含子開始）和AG（內(nèi)含子末尾）序列，推測(cè)如果可以精que地將G突變成A，可以特異性阻斷外顯子識(shí)別，調(diào)控內(nèi)源性mRNA的剪切。通過這一策略，利用TAM誘導(dǎo)剪接位點(diǎn)DNA上G>A突變，就可以誘導(dǎo)可變外顯子(alternative exon)及組成性外顯子(constitutive exon)的跳讀 (Exon skipping)；改變可變剪接位點(diǎn)的選擇(Alternative splice site)；調(diào)節(jié)互斥外顯子的選擇(mutually exclusive exons)；誘導(dǎo)小的內(nèi)含子的包含 (intron retention)。此外，如果通過TAM將３’剪接位點(diǎn)上游polypyrimidine track中包含的C向T突變，可以促進(jìn)下游外顯子的包含。因此，利用TAM可以成功地實(shí)現(xiàn)針對(duì)RNA剪接的“l(fā)oss of function”和”gain of function”調(diào)控。

zui后，研究人員探索了利用TAM修復(fù)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）的可行性。DMD是一種致命的遺傳疾?。òl(fā)病率男性中1/4000）。其發(fā)病原因在于，遺傳突變?cè)斐蒁ystrophin蛋白的完全缺失，引發(fā)肌肉萎縮和癱瘓，zui終造成心臟或肺功能的衰竭。如果通過外顯子跳讀，能產(chǎn)生內(nèi)部截短的Dystrophin蛋白，可以達(dá)到對(duì)DMD的治療效果。因此研究人員構(gòu)建了DMD病人來源的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞，此病人因?yàn)橥怙@子刪除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通過在剪接位點(diǎn)誘導(dǎo)G>A的突變，研究人員實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)外顯子的完全跳讀，在所有表達(dá)TAM的細(xì)胞中恢復(fù)了Dystrophin的蛋白表達(dá)，修復(fù)了心肌細(xì)胞的缺陷。