色譜法是生命科學、材料科學、環(huán)境科學等科學領域的重要分析手段，在藥物分析中有著為重要的地位。    色譜法是生命科學、材料科學、環(huán)境科學等科學領域的重要分析手段，在藥物分析中有著為重要的地位。
    色譜柱中固定不變的物質是固定相，攜帶樣品向前流動的是流動相，色譜類型較多，從不同角度可以有不同的分類方法。
    色譜法分類
    1、按流動相和固定相所處狀態(tài)分類：
流動相為氣體的稱為氣相色譜，流動相為液體的稱為液相色譜。固定相為固體的可分為氣固色譜(GSC)或液固色譜（LSC），固定相為液體的有氣液色譜（GLC）或液液色譜（LLC）。
    2、按固定相的形態(tài)分類：
    可分為柱色譜法、平面色譜法，如，紙色譜法、薄層色譜法等。
    3、按分離過程的機制分類：
    可分為分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法和空間排阻色譜法等類型，后兩者只存在于 液相色譜中。
    另外，還有其他分離機制的色譜方法，如，毛細管電泳法，根據(jù)組分的電泳速度差異而實現(xiàn)分離。
    色譜流出曲線與有關概念
    （一）色譜流出曲線和色譜峰：
    1、色譜流出曲線：在色譜分析中,樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器,所得到的信號-時間曲線,稱為色譜流出曲線(elution profile),又稱色譜圖。
    2、基線：在操作條件下，沒有組分流出、僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時所形成的流出曲線。穩(wěn)定的基線應是一條平行于橫軸的直線。基線反映儀器（主要是檢測器）的噪聲隨時間的變化。
    3、色譜峰：流出曲線上的突起部分，正常的色譜峰為正態(tài)分布曲線，曲線有zui高點，以此點的橫坐標為中心，曲線對稱的向兩側快速、單調下降。
    一種組分的色譜峰可用峰高或峰面積（用于定量）、峰位（用保留值表示，用于定性）及峰寬（用于衡量柱效）說明。
    色譜流出曲線（色譜圖）和區(qū)域寬度
    （二）保留值：
    1、保留時間（retention time）:色譜圖橫軸上從進樣開始到某個組分的色譜峰頂點的時間間隔為該組分的保留時間。
    2、死時間：不被固定相保留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰大值時的時間間隔。
    3、調整保留時間：組分被固定相滯留的時間。
    4、保留體積：從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度大時，所需通過色譜柱的流動相體積，單位為mL。
    5、死體積：不被固定相保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積。
    6、調整保留體積：保留體積減去死體積。
    7、相對保留值：兩組分的調整保留值之比，也是色譜系統(tǒng)的選擇性指標。
    （三）色譜峰高和峰面積：
    1、峰高（peak height, h）：色譜峰頂點至基線的距離。
    2、峰面積（peak area, A）：色譜曲線與基線間包圍的面積。
    （四）色譜峰區(qū)域寬度：
    1、標準差：正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點間距離之半。
    2、半峰寬：峰高一半處的峰寬。
    3、峰寬：通過色譜峰兩拐點作切線在基線上所截得的距離。
    （五）分離度：
    又稱分辨率或分辨度，它是色譜圖中相鄰兩峰分離程度的量度。
    現(xiàn)在，說一說氣相色譜
    特點：
    分離效能高
    靈敏度高
    樣品用量少
    分析速度快
    應用范圍廣
    固定相：
    對固定相要求：
    ① 在操作溫度下應呈液態(tài)，且蒸氣壓要很低，否則易造成固定液流失，使色譜柱壽命下降，檢測器本底增高。
    ② 對各組分應有較高的選擇性，即各組分的分配系數(shù)有較大的差異，從而獲得良好的分離效果。
    ③ 對分析樣品中的各組分有良好的溶解能力。
    ④ 具有良好的穩(wěn)定性，即在高溫下不分解和不與載體發(fā)生化學反應。
    ⑤ 對載體具有良好的潤濕性，能在載體表面形成均勻的薄膜。
    固定液的分類：
    按固定液化學類型分類
    烴類、聚硅氧烷類、醇類、酯類
    氣相色譜儀的維護保養(yǎng)
    （1）嚴格說明書要求，進行規(guī)范操作，這是正確使用和科學保養(yǎng)儀器的前提。
    （2）儀器應該有良好的接地，使用穩(wěn)壓電源，避免外部電器的干擾。
    （3）使用高純載氣，純凈的氫氣和壓縮空氣，盡量不用氧氣代替空氣。
    （4）確保載氣、氫氣、空氣的流量和比例適當、匹配，一般指導流速以次為載氣30mL/min，氫氣30mL/min，空氣300mL/min，針對不同的儀器特點，可在此基礎上，上下做適當調整。
    （5）經(jīng)常進行試漏檢查（包括進樣墊），確保整個流路系統(tǒng)不漏氣。
    （6）氣源壓力過低，氣體流量不穩(wěn)，應及時更換新鋼瓶，保持氣源壓力充足、穩(wěn)定。
    （7）新填充的色譜柱不能馬上使用還需要進行老化處理，避免固定液流失，產(chǎn)生噪音。
    （8）注射器要經(jīng)常用溶劑（如丙酮）清洗。試驗結束后，立即清洗干凈，以免被樣品中的高沸點物質污染。
    （9）要盡量用磨口玻璃瓶作試劑容器。避免使用橡皮塞，因其可能造成樣品污染。如果使用橡皮塞，要包一層聚乙烯膜，以保護橡皮塞不被溶劑溶解。
    （10）避免超負荷進樣（否則會造成多方面的不良后果）。對不經(jīng)稀釋直接進樣的液態(tài)樣品進樣體積可先試0.1uL（約100ug），然后再做適當調整。
    （11）對于欠穩(wěn)定的農藥、中間體，zui好用溶劑稀釋后再進行分析，這樣可以減少樣品的分解。
    （12）密封墊分一般密封墊和耐高溫密封墊，汽化室溫度超過300℃時用耐高溫密封墊，耐高溫密封墊的一面有一層膜，使用時帶膜的面朝下。
    （13）保持檢測器的清潔、暢通。為此，檢測器溫度可設得高一些，并用乙醇、丙酮和專用金屬絲經(jīng)常清洗和疏通。
    （14）保持氣化室的惰性和清潔，防止樣品的吸附，分解。每周應檢查一次玻璃襯管，如污染，清洗烘干后再使用。
    （15）要定期更換空氣泵，氫氣發(fā)生器的硅膠和活性碳。
    （16）操作過程中，一定要先通載氣再加熱，以防損壞檢測器。
    （17）在使用微量進樣器取樣時要注意不可將進樣器的針芯完全拔出，以防壞進樣器。
    （18）進樣口溫度一般應高于柱溫30～50度。檢測器溫度不能低于進樣口溫度，否則會污染檢測器進樣口溫度應高于柱溫的zui高值，同時化合物在此溫度下不分解
    （19）含酸、堿、鹽、水、金屬離子的化合物不能分析，要經(jīng)過處理方可進行。
    （20）進樣器所取樣品要避免帶有氣泡以保證進樣重現(xiàn)性。
    （21）取樣前用溶劑反復洗針，再用要分析的樣品至少洗2～5次。
    （22）儀器要定期空走程序升溫老化柱子，這樣會提高柱子的使用壽命和降低儀器污染。
    液相色譜的那些知識
    液相色譜法的優(yōu)缺點
    優(yōu)點：
    分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化，應用范圍廣；
與氣相色譜法相比具有的優(yōu)點：不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，應用范圍廣；流動相種類多，可通過流動相的優(yōu)化達到高的分離效率；一般在啊室溫下分析即可，不需高柱溫。
    缺點：
    分析成本高，液相色譜儀價格及日常維護費用貴，分析時間一般比氣相長。
    操作注意事項
    1、色譜柱的柱效和保護柱
    拿到一根新柱時，一定要先看其使用說明，然后測柱效，定期檢測柱效，保留在新色譜柱上得到的色譜圖，并記錄條件，定期檢測儀器的譜帶展寬，若應用于在線監(jiān)測，應對色譜柱提供在線的物理保護和化學保護，例如采取安裝在線過濾器，自裝填料保護柱和預裝保護柱等。在線過濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計，優(yōu)點是基本不影響柱效，在需要高柱效的時候常用，常更換的消耗品是濾芯和墊圈。
    保護柱的作用是防止柱子被化學污染，缺點是多數(shù)保護柱影響色譜柱的柱效，特別是在用微柱時，常用的是普通自裝填料的保護柱。zui近新出的一些保護柱例如Sentry-guard保護柱,它的特點是高質量、填料、增加分析柱效、對臟樣品載荷能力大，能延長保護柱的壽命，手可擰緊接頭，安裝時不需要工具，省時省，可換芯式設計，能采用各種不同的填料，主要適用于非常臟非常復雜的樣品本底，例如，生化樣品，環(huán)境樣品和食品等，或者不想做太多的固相萃取，不想降低柱效果等情況。
    2、色譜柱的清洗
    對所做的樣品要有充分的了解，用對該樣品洗脫能力zui強的流動相清洗，對于硅膠柱，先用甲醇洗去性雜質，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷100-200mL 依次活化，對于鍵和相柱，一般用甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗， 每種色譜柱有特定的清洗方法， 一定要看其使用說明。
    3、色譜柱的存放
    存放前除去雜質和鹽，采用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的干枯，避免機械振動，防止細菌生長，注意存放的溫度。
    色譜柱的常見故障及排除
    1、柱壓過高
    可能是微粒堵塞，柱床膨脹，不可逆吸附，細菌生長等造成的。也有可能是系統(tǒng)反壓問題，例如阻尼器堵塞，進樣器堵塞，管路或連接口堵塞，在線過濾器不干凈，壓力傳感器不準確等。
    2、柱效低
    可能是色譜柱被污染、過濾片部分堵塞、色譜柱內的死體積造成，例如，流動相pH值或者組成不合適造成固定相損失，流動相急劇變化造成固定相物理損壞，機械振動造成固定相產(chǎn)生裂縫，柱床收縮或干枯。也有可能是儀器連接的問題，認真檢查進樣器、檢測器、管路、保護柱和在線過濾器等是否連接好，也可能是色譜柱沒有平衡好，進樣量過大等問題。
    3、重復性差、不出峰、回收率低
    可能是色譜柱被污染，流動相pH 值或者組成不合適造成固定相損失，樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定，固定相性過強或者流動相性過弱，或者發(fā)生非特異性吸附。也可能梯度實驗時平衡時間不足，溫度波動，流動相組成改變，樣品溶劑不同，樣品穩(wěn)定性不好，方法的開發(fā)不好，緩沖液的酸堿度不合適或者緩沖能力不足。
    小結

    色譜法是先將混合物中各組分分離，而后逐個分析，因此，是分離分析復雜混合物有利手段，具有高靈敏度、高選擇性、能、速度快、應用范圍廣等優(yōu)點。

                                                                                       （本文內容來源于網(wǎng)絡，如有侵權請聯(lián)系我們刪除）