Elisa實驗| ELISA實驗操作步驟及注意事項

  一、ELISA實驗步驟

  1、固相載體選擇

  聚苯乙烯:具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。

  聚氯乙烯:聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

  良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

  2、包被

  ①板孔的選擇:ELISA級別的微孔板;

  ②抗體選擇:選擇優(yōu)質(zhì)的ELISA實驗的抗體，根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索適濃度;

  ③包被緩沖液:pH7.2磷酸鹽緩;

  ④包被溫度:2-8C過夜包被或室溫 (37C)包被2h;

  ⑤包被濃度:包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為lug/m-2ug。

  3、封閉

  D包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)@選擇效果較好的封閉劑 (細胞培養(yǎng)級BSA、Tween等)

  4、加樣及孵育

  ①加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部;

  ②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉(zhuǎn)速在500+50rpm;

  ③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據(jù)說明書提示;@洗板對于ELISA來說，是極其關(guān)鍵的一步，保證ELISA的特異性;

  封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

  做ELISA實驗需要注意哪些問題?

  1、ELISA操作前準備工作

  試劑盒的選擇ELISA操作前，應(yīng)做好實驗的設(shè)計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。

  樣本處理在收集標本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成分是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4°C備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請取材后，將標本及時分裝后放在-20C或-80C條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。

  2、ELISA標準品稀釋

  標準品嚴禁反復(fù)凍融。標準品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準備，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時，應(yīng)充分混勻;采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內(nèi)進行倍比稀釋時，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

  注意:@品牌試劑盒標準品是已倍比稀釋好的，是即用型標準品。

  3、ELISA操作中的洗滌

  洗滌是ELISA實驗中是多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實驗重復(fù)效果差的現(xiàn)象。

  不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數(shù)。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象，請比照“手工洗板小貼士”操

  a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。

  b)特別注意:設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。

  c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。

  d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，后一次一定要扣干凈。

  e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景干凈。

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