GST瓊脂糖凝膠由專業(yè)試劑供應(yīng)商北京百奧萊博提供，僅用于生物化學(xué)研究方面，我公司專注于蛋白質(zhì)研究產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的GST瓊脂糖凝膠質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括GST瓊脂糖凝膠在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：GST瓊脂糖凝膠
英文名稱：Glutathione-Sepharose Resin
產(chǎn)品貨號：WE0269
產(chǎn)品規(guī)格：10ml

  本產(chǎn)品為基于三甘醇(16原子間隔臂)的谷胱甘肽瓊脂糖，可快速、溫和、特異性地純化包含谷胱甘肽結(jié)合序列的非變性蛋白質(zhì)，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶等，尤其適用于在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和哺育動物細(xì)胞中表達(dá)的GST融合表達(dá)蛋白。該填料具有很好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，使用壽命長，使用方便，批次重復(fù)性好，可一步分離得到純度較高的目標(biāo)蛋白，純化條件溫和，可保證蛋白的活性。

支持物：CL-6B瓊脂糖凝膠
載量：5-10 mg GST標(biāo)簽蛋白/ml 填料
粒徑：50-160μM

注意事項：
1、請勿將 GST瓊脂糖凝膠冷凍、干燥和離心，整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。
2、蛋白層析應(yīng)使用高純度的試劑和水，層析前緩沖液應(yīng)用0.45μM濾膜過濾后使用。另外為防止柱子阻塞，上柱前建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.45μM濾膜過濾。
3、GST 融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結(jié)合比較緩慢，為獲得zuì大結(jié)合量，上樣流速建議為：0.2-1ml/min(6ml層析柱)，0.5-2ml/min(12ml層析柱)。對于吸附效果不好的樣品，可以先把介質(zhì)和樣品混合，輕輕振搖 2-4小時，再裝柱，用平衡緩沖液進(jìn)行重新平衡、洗脫等操作，另外在細(xì)菌抽提試劑中添加5 mM DTT，可以顯著提高GST標(biāo)簽結(jié)合能力。
4、不同的 GST 融合蛋白取得zuì佳純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時間可能有所不同。必要時需對流穿液、洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE 以及 Western 雜交分析，以確定zuì佳純化條件。
5、GST 融合蛋白以包涵體形式存在時不能與介質(zhì)結(jié)合，必須行變性、復(fù)性、透析處理后才能用介質(zhì)進(jìn)行純化。建議優(yōu)化蛋白表達(dá)條件盡量使蛋白可溶性表達(dá)。
6、如后續(xù)實驗需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽，可采用超濾或透析的方法。

使用方法：

I 緩沖液的準(zhǔn)備
1、結(jié)合緩沖液(PBS)：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，pH7.4
2、洗脫緩沖液：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，10 mM還原型谷胱甘肽(GSH)，pH7.4。將0.1 g還原型谷胱甘肽(GSH)溶于30ml 結(jié)合緩沖液，或?qū)?.25 g溶于75ml結(jié)合緩沖液中。
3、再生緩沖液1：0.1 MTris-HCl，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH8.5
4、再生緩沖液2：0.1 M Sodiumacetate，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH4.5

II 樣本制備
1、收集菌體后，每100 mg菌體(濕重)加1-5ml細(xì)菌蛋白抽提試劑(每1ml細(xì)菌蛋白抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物)，如有需要可以超聲裂解菌體。
注意：
1)當(dāng)提取物粘度高時，建議加入DNase I和Lysozyme。每1ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1μlDNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可單獨從我公司購買，貨號：Lysozyme(WE0214)、 DNase I(WE0213A)，或直接從我公司購買WE0261細(xì)菌蛋白抽提試劑盒，包含細(xì)菌蛋白抽提試劑、DNase I、Lysozyme和蛋白酶抑制劑混合物。
2)超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致溶液過熱，可分成短時間，多次超聲，zuì終以菌液變清即可。
2、10000rpm，4℃離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的已預(yù)冷的離心管中，然后用預(yù)冷的PBS Buffer重懸沉淀(每50ml裂解液的沉淀加入3ml PBS)。
3、分別取10μl上清和沉淀懸液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，以確定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST融合蛋白形成包涵體(不可溶蛋白)，應(yīng)在純化以前以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行溶解和重折疊。

III 組裝層析柱
1、將Glutathione-Sepharose Resin混合均勻直至重懸，用吸管移取適量的填料至層析柱中。室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。
注意：
1)填料的上層是乙醇保護(hù)液，將填料與乙醇一起混勻，以每ml填料純化5-10 mg GST標(biāo)簽蛋白計算，取需要的填料與乙醇混合液加入層析柱中。
2)如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。
3)本實驗都是通過重力作用使溶液流出。
2、加入5倍柱體積的去離子水洗滌，再用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡，平衡結(jié)束后即可上樣。
注意：柱體積指的是填料的體積。

Ⅳ GST融合蛋白的純化
1、將層析柱的出口連接上紫外蛋白監(jiān)測儀，根據(jù)紫外蛋白監(jiān)測儀觀察280 nm處的吸收值來監(jiān)控層析柱流出蛋白情況。
2、上樣：將制備的蛋白樣品用結(jié)合緩沖液等體積稀釋后，加入到已平衡好的層析柱中，建議上樣流速為： 0.5-1ml/min(6ml層析柱)，1-2ml/min(12ml層析柱)。觀察280 nm吸收情況并收集流穿蛋白。
注意：
1)樣品在上柱前可以離心或0.45μM微孔濾膜過濾?；蛘呤褂帽驹噭┖兄懈綆У囊粔K篩板，使用時先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。
2)通過控制加入的菌體裂解液的速度或流出速度來控制柱流速，流速過快會影響柱效。
3、洗滌：使用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液過柱，洗滌雜蛋白，觀察280 nm吸收情況并收集雜蛋白。建議洗滌流速為0.5-1ml/min(6ml層析柱)，1-2ml/min(12ml層析柱)。
注意：建議洗滌液中加入蛋白酶抑制劑終濃度為1mM，如蛋白酶抑制劑混合物，以抑制蛋白酶活性。
4、洗脫：使用10-15倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液過柱，洗脫目的蛋白，觀察280 nm吸收情況并收集目的蛋白。建議洗滌流速為0.5-1ml/min(6ml層析柱)，1-2ml/min(12ml層析柱)。
5、蛋白檢測：分別取等量的流穿液，洗滌液和目的蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE以分析蛋白的層析情況。
6、洗脫后，依次用3-5倍柱體積的結(jié)合緩沖液和3-5倍柱體積的去離子水洗滌填料，再用2-3倍柱體積的20%乙醇洗滌(乙醇要將填料浸沒)，封柱后2～8℃保存。

Ⅴ 柱再生
當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會有下降，可用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
1、使用5倍柱體積的再生緩沖液1洗滌填料，而后用5-10倍柱體積超純水洗滌。
2、使用5倍柱體積的再生緩沖液2洗滌填料，而后用5-10倍柱體積超純水洗滌。
3、保存：使用2-3倍柱體積的20%乙醇洗滌，將層析柱的頭尾密封后(乙醇要將填料浸沒)2～8℃保存。
4、再次使用時加入5倍柱體積的去離子水將乙醇洗滌后，使用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡填料，平衡結(jié)束后即可上樣。

儲存條件：2～8℃，避免冷凍

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