SABC免疫組化試劑盒是高品質(zhì)的蛋白質(zhì)研究產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應，本產(chǎn)品用于科學研究，我公司的SABC免疫組化試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括SABC免疫組化試劑盒(小鼠/兔IgG)(DAB顯色)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：SABC免疫組化試劑盒(小鼠/兔IgG)(DAB顯色)
英文名稱：SABC(Mouse/Rabbit IgG)-POD Kit
產(chǎn)品貨號：QN1223
產(chǎn)品規(guī)格：100T-200T

本試劑盒適合于一抗為小鼠/兔IgG的免疫組化實驗，DAB顯色。

試劑盒組份：
封閉液(5% BSA)——————————10ml
3% H2O2-—————————————10ml
Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液—————200ul
SABC-POD濃縮液——————————100ul
稀釋液——————————————30ml
20×DAB顯色液A——————————1ml
20×DAB顯色液B——————————1ml

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設計的，用以顯示組織和細胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對生物素有高的親和力，親和素是一個堿性蛋白質(zhì)(IP=10)，經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點接近中性，對組織和細胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex，SABC大約可形成一百個左右的過氧化物酶和五十個左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。

操作步驟:(以石蠟切片為例)
1. 切片常規(guī)脫蠟至水(三次二甲苯，三次乙醇)。
2. 3% H2O2室溫處理5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
3. 可選步聚：
a、熱修復抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰 后斷電，間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS(pH7.2-7.6)洗滌1-2次。
b、酶消化，滴加消化液，37℃10分鐘，PBS(pH7.2-7.4)洗滌2-3次。
c、跳過此步，直接進入下一步。
4. 滴加5% BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 免洗。
5. 用稀釋液將一抗按一定比例稀釋(稀釋后的一抗4℃可保存一周)，也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗37℃ 孵育1小時左右或20℃ 2小時左右，也可4℃過夜。PBS(pH7.2-7.4)洗滌3次，每次2分鐘(一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間;背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間)。
6. 根據(jù)用量，用稀釋液將Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液按1:50-100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10-20ul Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加Bio-羊抗小鼠/兔IgG工作液,20-37℃ 孵育30分鐘。PBS(pH7.2-7.4)洗滌3次，每次2分鐘。
7. 根據(jù)使用量，用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS (pH7.2-7.4)洗滌4次，每次5分鐘。
8. DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS(pH7.2-7.4)配制，按1ml PBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。充分混勻后滴加到切片上。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應。
9. 蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

對于細胞爬片，固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5% Triton X-100室溫孵育20分鐘，PBS漂洗兩次，3% H2O2處理15分鐘;PBS漂洗兩次，接上述第4步。
對于冰凍切片，固定后，PBS漂洗兩次，接上述第二步。

注意事項：如果染色背景過高，在SABC反應之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST(pH7.2-7.4)洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。

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貨號	名稱	規(guī)格
BTN121208	液體樣品蛋白純化回收試劑盒	50次
YT058	考馬斯亮藍染色脫色液(常規(guī)法)	500ml
WE0315	免疫組化試劑盒(鼠源一抗)	3ml
SNM466	AEC	1g
KFS044	Cy3標記抗兔免疫熒光染色試劑盒	300T
KFS072	1%封閉試劑(1×PBS)	500ml
KFS083	2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液	5ml

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名稱：一站式MBP標簽蛋白純化套裝
貨號：BTN130871
規(guī)格：2mL
MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白，Maltose Binding Protein)標簽蛋白大小為40 kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化，結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除?？捎肕BP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測MBP標簽標記的重組蛋白。由于MBP融合蛋白原核表達載體具有表達效率高，易于純化等優(yōu)點。在現(xiàn)代分子克隆中MBP常作為融合蛋白被廣泛應用。本產(chǎn)品就是專門用于分離純化MBP融合蛋白的試劑盒，其原理如下：


產(chǎn)品特點：
1．一站式套裝，含所需的直鏈淀粉和瓊脂糖介質(zhì)、溶液和層析柱，操作非常方便。
2．提供 2mL直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)，其zuì大載量為10mg MBP蛋白/mL介質(zhì)。
3．采用麥芽糖溫和洗脫，無去污劑和變性劑對蛋白活性的影響。
4．本介質(zhì)可以反復使用多次。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)	2ml
1 M Tris-HCl(pH7.4)	25ml
0.1 M EDTA溶液	25ml
2 M NaCl溶液	50ml
蔗糖	20g
PMSF(10mg/mL)	1ml
0.1mM MgCl2溶液	50ml
0.1 M麥芽糖溶液	25ml
層析柱(6mL)	1支
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存，但介質(zhì)需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1．將直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后，取適量加入到預放了一片篩板的層析柱中(介質(zhì)用量需要根據(jù)MBP蛋白產(chǎn)量決定，其zuì大載量為10mg MBP蛋白/mL介質(zhì)，請根據(jù)實驗需要取適量的介質(zhì)加入層析柱中)。
2．用5倍柱體積(柱體積指的是填料介質(zhì)的體積，下同)自備去離子水洗柱，共3次。
3．用5倍柱體積的新配的結(jié)合緩沖液洗柱，進行平衡，使填料介質(zhì)處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用。結(jié)合緩沖液的配方如下(以10mL為例)：

成分	用量	在結(jié)合緩沖液中的濃度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
2M NaCl溶液	1mL	200mM
自備去離子水	8.7mL	-

4．4℃ 5000g離心10分鐘收集20mL表達菌液，棄上清，將細胞沉淀(約100mg)懸于2mL冰冷的現(xiàn)配的細胞洗滌液中，4℃ 5000g離心15分鐘收集細胞沉淀后，再次懸于2mL冰冷的細胞洗滌液中。(zuì好用不加誘導物的菌液做對照樣。)細胞洗滌液的配方如下(以10mL為例)：

成分	用量	在細胞洗滌液中的濃度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.1mL	10mM
2M NaCl溶液	0.15mL	30mM
自備去離子水	9.75mL	-

5．制備細胞裂解物：
1)如果所用載體不帶MBP信號肽序列(如pMAL-c2)
a)超聲破碎細胞，功率30 W，保持細胞低溫(0℃)，直到在顯微鏡下看見大多數(shù)細胞破裂。(超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，但裂解物必須不粘稠，否則會堵塞層析柱。)
b)為使溶液澄清，向上述細胞洗滌液中加入35μl PMSF(10mg/mL)。
c)4℃下13000-15000g離心30分鐘，以去除殘留細胞和細胞碎片以防堵柱，收集上清樣品，留樣做 SDS-PAGE電泳對照，其余樣品用于純化MBP融合蛋白，直接進入第6步。
2)如果所用載體帶MBP信號肽序列(如pMAL-p2)
a)4℃ 5000g離心15分鐘收集細胞，沉淀懸于1mL冰冷的現(xiàn)配的細胞裂解液中。細胞裂解液的配方如下(以10mL為例)：

成分	用量	在細胞裂解液中的濃度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.3mL	30mM
0.1M EDTA溶液	0.01mL	0.1mM
蔗糖	2g	20%(m/V)
自備去離子水	加水到10mL	-

b)加入25μl PMSF(10mg/mL)，室溫攪動15分鐘，于4℃ 13000-15000g離心10分鐘收集細胞。
c)旋動細胞沉淀，加入2mL冰冷的0.1mM MgCl2溶液，4℃攪動10分鐘。
d)休克細胞4℃ 13000-15000g離心10分鐘，在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)(可將1 M Tris-HCl，pH7.4稀釋100倍配制而成)至pH為7.4。
e)上清用0.22μm或0.45μm濾膜過濾，濾液用100倍體積的10mM Tris-HCl(pH7.4)(配方如上)4℃透析。
f)收集透析后樣品，留樣做 SDS-PAGE電泳對照，其余樣品用于純化MBP融合蛋白，直接進入第6步。
6．將樣品加到平衡好的直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)中(保證目的蛋白與介質(zhì)充分接觸，以提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。
7．用10-15倍柱體積的結(jié)合緩沖液(配方見上表)進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。
8．使用5-10倍柱體積的現(xiàn)配的麥芽糖洗脫液洗脫結(jié)合的融合蛋白，收集洗脫液(即目的蛋白組分)。麥芽糖洗脫液的配方如下(以10mL為例)：

成分	用量	在麥芽糖洗脫液中的濃度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
0.1M麥芽糖溶液	1mL	10mM
自備去離子水	8.7mL	-

9．將純化得到的樣品(包括流出液、洗雜液和洗脫液)以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。
10．填料介質(zhì)清洗：依次使用3倍柱體積的結(jié)合緩沖液和5倍柱體積的去離子水平衡介質(zhì)，zuì后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被細菌污染。本介質(zhì)可重復使用。
蛋白酶切割釋放靶蛋白(可選步驟，所用試劑需自備)
11．用適當?shù)牡鞍酌盖懈钊诤系鞍揍尫虐械鞍住?br /> 1)加入自備的凝血酶、腸激酶或Xa因子(根據(jù)融合蛋白中的位點選擇)。每毫升介質(zhì)中加入50單位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2-16小時。
2)4℃以500 g離心5分鐘，上清小心轉(zhuǎn)移到新離心管中。
3)用傳統(tǒng)的層析方法或SDS-PAGE電泳分離靶蛋白和蛋白酶。

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